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Medicina Personalizada

Medicina Personalizada
medicina personalizada
A la hora de definir los términos conocidos como “medicina personalizada MP” o lo que es lo mismo “modelo de atención personalizado” nos encontramos con varias definiciones y todas ellas coinciden en que se trata de un procedimiento por el cual se establece un tratamiento médico concreto y adecuado a las características individuales del paciente.

Tras la realización de numerosos estudios de investigación, se ha llegado a la conclusión de que no todos los pacientes se comportan de la misma manera ante la enfermedad ni al tratamiento asignado para ella, nos encontramos en un momento en el que no se trata a todos los pacientes por igual sino que los individuos son clasificados en subpoblaciones según las características de su enfermedad y de esta manera se puede concretar el diagnóstico de la misma y utilizar el tratamiento adecuado con el fin de mejorar la efectividad del mismo y a su vez disminuir los efectos secundarios que pueda originar. Dicho de otra manera es dar el mejor tratamiento a la persona adecuada en el momento óptimo.

“La medicina personalizada, presenta un gran potencial como herramienta diagnóstica y preventiva pero sobre todo proporciona una mayor seguridad al paciente, al posibilitar, por una parte, la elección del fármaco y dosis adecuada y precisa, y por otra, disminuir el riesgo de los efectos adversos”.

El estudio principal que nos permite clasificar a los individuos en subpoblaciones es el estudio genético y con él se desarrolla la farmacogenómica que se encarga de estudiar las variaciones de los genes heredados y su efecto en la reacción bien sea positiva, negativa o neutra a determinado medicamento y su correspondiente dosis para tratar una enfermedad.

DETERMINACIÓN DE BIOMARCADORES MOLECULARES

Varios ensayos clínicos realizados han demostrado que el estado mutacional de determinados biomarcadores indica si un paciente respondería a determinados tratamientos biológicos.

El estudio de estos biomarcadores debe realizarse en un entorno asistencial que garantice los controles de calidad adecuados y la disponibilidad de los resultados en el tiempo recomendado. No cabe duda de que la complejidad del abordaje del cáncer requiere, cada vez más, una estrecha colaboración entre distintos profesionales, y que el éxito de la implantación de estrategias terapéuticas individualizadas basadas en el uso de biomarcadores en el entorno asistencial necesita coordinación entre patólogos y oncólogos.

Para la realización de la determinación de biomarcadores, la Unidad Provincial Intercentros de Anatomía Patológica de Granada cuenta con personal técnico y Facultativo especializado en Biología Molecular y el obtener resultados de calidad está corroborado por la Sociedad Española de Anatomía Patológica (SEAP) a la que se encuentra inscrita desde el año 2012 con objetivo de pasar los controles de calidad externos necesarios.

Actualmente los biomarcadores que se estudian en la Unidad y que tienen valor predictivo y pronóstico son:

- HER2/neu en pacientes diagnósticadas de cáncer de mama.

- EGFR y ALK en pacientes con carcinoma pulmonar.

- K-RAS y N-RAS en pacientes con carcinoma colorrectal.

- B-RAF en pacientes con carcinoma de piel o melanoma.

FAMILIA HER

Familia Her
Hay numerosos receptores de crecimiento que se encuentran ubicados en la membrana celular y cuya función es recibir la acción de ligandos por medio de los cuales llevarán a cabo su activación. Estos receptores una vez activados van a iniciar una cascada de reacciones que darán lugar a: proliferación celular, señales de supervivencia, estímulos de la angiogénesis, activación del proceso de invasión tisular y metástasis.

Entre ellos hay una familia denominada HER o c-erb B que ha sido el blanco de terapias con éxito clínico.

La familia de receptores EGF, también conocida como HER, consta de 4 miembros: HER1 (EGFR), HER2, HER3 y HER4, todos son receptores de membrana y están constituidos por un dominio extracelular, un dominio de transmembrana y un dominio intracelular, con actividad tirosina kinasa (en la porción extramembranosa se encuentran los sitios de inserción de los ligandos y en la intracitoplasmática dominios de actividad de tirosina quinasa) la acción del ligando provoca un cambio conformacional que facilita la unión de dos receptores, ya sea el mismo tipo (homodimerización) o de dos tipos distintos (heterodomerización).

Con la excepción del Her3, todos tienen fuerte actividad tirosina kinasa en su dominio intracelular y a excepción de Her2 todos los demás miembros de la familia Her tienen ligandos conocidos. Su sobre-expresión puede generar el fenotipo oncológico, específicamente con aumento de la proliferación celular, y la evasión de la apoptosis, entre otros efectos.

Los dímeros activan sus respectivas tirosinas kinasas en el dominio intracelular por medio de fosforilaciones sucesivas. La unión con los ligandos y la (homo / hetero)-dimerización de los receptores desencadenan cascadas de eventos intracelulares resultantes de la activación del EGFR. Otras dos de las vías principales: la activación de la cascada RAS, RAF, y ERK – que causan fundamentalmente proliferación celular (vía de la MAP Kinasa); y la cascada de la PI3K que culminan en señales antiapoptóticas evitando la muerte celular.

Las acciones terapéuticas de mayor interés se han realizado sobre HER-2, en cáncer de mama y sobre HER-1 en cáncer de colon y pulmón.

Los quimioterapéuticos que se han desarrollado para actuar sobre estos receptores son de dos tipos:

- moléculas grandes, anticuerpos monoclonales que van a actuar sobre la porción extra membranosa del receptor (Trastuzumab y Pertuzumab dirigidos contra el receptor HER-2 y Cetuximab dirigido contra EGFR entre otros).
- inhibidores de tirosina quinasa, moléculas pequeñas que van a actuar sobre el dominio tirosina quinasa bloqueando de ese modo la activación del receptor (Erlotinib y Gefitinib asociados a EGFR y Lapatinib asociado a Her-2 entre otros)

HER-2/neu

TÉCNICAS HER2
En los últimos años, el estudio de los oncogenes celulares ha sido uno de los campos de mayor investigación dentro de la Biología Molecular y la Medicina. Se conoce que la activación y la sobre-expresión de estos oncogenes cumplen un importante papel en el desarrollo del cáncer, lo que permite obtener información adecuada para la evaluación de las decisiones terapéuticas a aplicar en cada caso.

Dentro de esta familia de oncogenes se encuentra el HER-2/neu, sigla proveniente de Human Epidermal Growth Factor Receptor-2. El gen HER-2/neu codifica un receptor para factores de crecimiento que se expresa en células epiteliales normales. Es una proteína, denominada p185, de 185 kDa de peso molecular, presente en la superficie celular con funciones en el crecimiento y proliferación celular. Se supone que cada célula tiene dos copias del gen HER-2, pero por razones aún desconocidas, algunas células cancerosas poseen múltiples copias de dicho gen (amplificación genética) lo que se traduce en una sobre-expresión de la proteína HER-2/neu.

La oncoproteína HER-2/neu está compuesta por tres dominios: el dominio citoplasmático con actividad de tirosina quinasa, el dominio transmembrana y el dominio extracelular que es la porción que interactúa con los factores de crecimiento y con los dominios extracelulares de otros miembros de la familia HER-2/neu, como HER-1, HER-3 y HER-4 que también son receptores de la superficie celular para factores de crecimiento.

Desde 1980, se ha descrito que el oncogen HER-2/neu y su producto proteínico intervienen en el desarrollo del cáncer de mama y de sus metástasis. Se estima que un 20-30% de los cánceres de mama sobre-expresan esta proteína. Los tumores que presentan la sobre-expresión son más agresivos, tienen un crecimiento más rápido, una mayor probabilidad de recurrencia post-tratamiento y pueden responder de manera diferente a las terapias habituales. El significado de la positividad para HER-2/neu tiene valor pronóstico, dado que se asocia con una enfermedad más agresiva y valor predictivo porque permite la identificación de pacientes que pueden beneficiarse de Herceptin (anticuerpo monoclonal que se une al receptor HER-2/neu, bloqueándolo, previniendo la estimulación del crecimiento celular e inhibiendo así el cáncer).

Para la determinación de HER-2 no existe un gold estandar universalmente aceptado pero se dispone de cuatro técnicas aceptadas: FISH, CISH, SISH e Inmunohistoquímica.

- ISH (hibridación in situ):medida de la amplificación del gen HER-2/neu que permite identificar cuántas copias del gen están presentes dentro de las células cancerosas. Si se detectan más de dos copias del gen, se considera que existe amplificación y el resultado es HER-2/neu será positivo para dicha muestra. Las técnicas IHS pueden tener distintas formas de rebelado y enfunción de esta tendremos: FISH, CISH, SISH o DUO-CISH.

- Inmunohistoquímica (IHC): permite identificar la sobre-expresión de la proteína HER-2/neu en el tejido tumoral, utilizando anticuerpos específicos contra los receptores HER-2/neu para medir la expresión de la proteína p185.

Actualmente en nuestra unidad se está utilizando la técnica de DUO-CISH (CISH a doble color) porque combina las ventajas del FISH y el CISH

EGFR (HER1, Epidermal Growth Factor Receptor)

SEÑALIZACIÓN DE EGFR 1

Esquema de señalización mediada por epidermal growth factor receptor (egfr). Rev Esp Patol. 2012;45(2):76-85

El EGFR es una glucoproteína transmembrana compuesta por:

- un dominio extracelular amino-terminal para la unión de ligandos,
- una hélice transmembrana hidrófoba
- y un dominio citoplasmático que contiene el dominio tirosina quinasa y una región carboxi-terminal que contiene residuos de tirosina y elementos reguladores del receptor.

El EGFR puede ser activado por diversos ligandos, como:

- el factor de crecimiento epidérmico (EGF-)
- el factor transformador de crecimiento (TGF-).

La unión de los ligandos al dominio extracelular dan lugar a la oligomerización del receptor que activa la porción tirosina quinasa de la molécula y origina la autofosforilación de ambos dominios del receptor. Estas tirosinas fosforiladas sirven como sitios de unión para diferentes moléculas transductoras de señales citoplasmáticas.

Se inicia así la cascada de acontecimientos intracelulares que conduce a:

- la proliferación celular (incremento del número de células por división celular.) Una serie de trastornos del crecimiento pueden ocurrir a nivel celular y pueden tener como consecuencia un crecimiento incontrolado y una división más allá de los límites normales,

- protección frente a apoptosis (destrucción o muerte celular programada provocada por la misma célula con el fin de autocontrolar su desarrollo y crecimiento, está desencadenada por señales celulares controladas genéticamente. La apoptosis tiene una función muy importante en los organismos, pues hace posible la destrucción de las células dañadas, evitando la aparición de enfermedades),

- mayor supervivencia y transcripción génica(proceso mediante el cual se transfiere la información contenida en la secuencia del ADN hacia la secuencia de proteinautilizando diversos ARNscomo intermediarios.

Tanto las células neoplásicas como las normales dependen de las señales del EGFR, pero en las células normales dicha señal se encuentra estrictamente regulada y las células tumorales muestran lo que ha sido llamado una «adicción» a esta ruta.

El EGFR ha sido reconocido durante mucho tiempo como un modulador clave de las funciones celulares tumorales, y por ello ha sido objeto de interés como diana para el desarrollo de fármacos. Hasta el momento se dispone de anticuerpos monoclonales humanizados generados contra la porción extracelular del receptor que impiden la unión de ligandos y también de pequeñas moléculas que compiten con el adenosín trifosfato de la región intracelular con actividad tirosina quinasa, bloqueando así la activación del receptor y la transducción de señales posreceptor.

Descubrimiento de las mutaciones del EGFR y su papel predictivo.

MUTACIONES EGFR 1

Arteaga 2006, Gadzar et al 2004, Hendricks et al 2006, sordella et al 2004.

Existen múltiples estudios que han demostrado el importante papel que la vía de señalización mediada por el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) posee en el desarrollo del carcinoma pulmonar no microcítico (CNMP). Este hecho queda reforzado además por el descubrimiento de que las mutaciones en dicho receptor se comportan como elemento predictivo de respuesta a los fármacos inhibidores de la actividad tirosina quinasa, es decir: aquellos carcinomas de pulmón no microcíticos (CNMP) que además presentan mutaciones en el receptor EGFR responden mejor a determinados fármacos terapéuticos.

Una importante línea de investigación en oncología es la búsqueda de tratamientos dirigidos contra dianas específicas que actúen de forma selectiva. En este sentido, en el CPNM ha sido crucial la investigación de la vía del EGFR (epidermal growth factor receptor), que está activada en el 43-83% de los pacientes, sobre todo en los carcinomas escamosos (70%), seguido de los adenocarcinomas (50%) y menos frecuentemente en los carcinomas de células grandes. Es un evento infrecuente en los tumores de células pequeñas.

En el año 2004, grupos independientes de investigadores identificaron mutaciones somáticas en el dominio de la tirosina quinasa del gen EGFR en pacientes con respuesta clínica a fármacos dirigidos (gefitinib). Las mutaciones más frecuentes son deleciones in-frame de los nucleótidos 9, 12, 15, 18, o 24 en el exón 19 y mutaciones puntuales CTG/CGG en el exón 21(L858R). Existen otras menos comunes (L861Q en el exon 21, G719A/C/S en el exon 18 y S7681 en el exon 20) cuyo comportamiento es menos conocido. Además se han descrito mutaciones asociadas a la resistencia frente a T790M en el exon 20.

Estas mutaciones dan lugar a un incremento de la actividad del factor de crecimiento y confieren susceptibilidad al inhibidor porque conllevan cambios conformacionales que incrementan la sensibilidad de las células tumorales a los inhibidores. En otras palabras, estas mutaciones convierten a la célula mutada en «adicta» a las señales del EGFR. Cuando se administra un inhibidor, la activación del EGFR, necesaria para la supervivencia celular, se interrumpe provocando la muerte celular.

Resumen y explicación de la prueba.

Las mutaciones activadoras del gen codificador del gen receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se producen básicamente en el cáncer pulmonar de células no pequeñas (CPCNP) y su acción da lugar a la activación constitutiva de la actividad de la proteína quinasa del EGFR, lo que contribuye al proceso oncogénico. Sin embargo, estas mutaciones suelen producirse con mayor frecuencia, aunque no de manera exclusiva, en mujeres no fumadoras o fumadoras ocasionales de origen asiático y con histología de adenocarcinoma.

Los datos clínicos indican que los pacientes afectados por tumores avanzados de CPCNP con mutaciones activadoras del EGFR, y que suelen manifestarse mayoritariamente como deleciones del exón 19 o como la mutación puntual L858R del exón 21, muestran una tasa de respuesta elevada y una tasa de supervivencia prolongada sin progresión cuando son tratados mediante terapias anti-EGFR con TKI, tanto durante el tratamiento de primera línea como durante el de segunda línea.

Otras mutaciones menos frecuentes del EGFR, como las sustituciones G719X del exón 18 y la mutación puntual L861Q del exón 21, también son predictivas de la respuesta a las terapias anti-EGFR.
Principios del procedimiento utilizado en nuestra unidad de anatomía patológica.
La prueba de mutación en EGFR decobas®se basa en dos procesos básicos:

(1) preparación manual de las muestras para obtener ADN genómico de un tejido impregnado en parafina y fijado en formalina (FFPET)

(2) amplificación del ADN objetivo mediante PCR y pares de cebadores (primers) complementarios y sondas oligonucleótidas con marcadores fluorescentes. La prueba se ha diseñado para la detección de las mutaciones G719X (G719A, G719C y G719S) en el exón 18, deleciones y mutaciones complejas en el exón 19, S768I, T790M, inserciones en el exón 20 y L858R en el exón 21.

La detección de la mutación se realiza mediante el análisis de PCR con el analizadorcobas z480. Cada serie incluye un control de mutación y un control negativo para confirmar la validez de la serie.

El resultado que se obtiene al realizar el estudio mutacional del gen EGRF puede ser tanto mutado (presencia de mutaciones en cualquiera de los codones anteriormente citados) como no mutado o nativo (wildType).

En aquellos cosos en los que se detecta ausencia de mutaciones, EGFR wild Type, está recomendado el estudio de reordenamiento de ALK.

IMPORTANCIA CLÍNICA DE LA TRANSLOCACIÓN DE EML4-ALK

ALK
ALKes una proteína transmembrana, un receptor tirosina quinasa de la insulina. Este receptor fue identificado por primera vez como parte de la traslocación t (2; 5)(desplazamiento de un segmento de un cromosoma aun nuevo lugar en el genoma) .asociada a la mayoría de los linfomas anaplásicos y algunos otros linfomas no hodgkinianos.

Se ha puesto de manifiesto recientemente que varios tumores humanos, como el CPNM (carcinoma de pulmón no microcítico), activan la señalización de ALK mediante la creación de fusiones del genALKcon diferentes parejas, dando lugar a proteínas que activan el dominio quinasa de ALK.

EML4es una proteína citoplasmática involucrada en la formación de microtúbulos,EML4-ALKes una fusión de genes que surge de la inversión del brazo corto del cromosoma 2 [Inv (2) (p21p23)] que une los exones 1-13 deEML4a los exones 20-29 deALK.

En CPNM se han identificado múltiples variantes deEML4-ALK, así como otros tipos menos frecuentes de fusiones génicas deALKcon otras parejas, como por ejemploTFG-11yKIF5B19.

De forma equivalente a las mutaciones de EGFR, los reordenamientos de ALK son otro ejemplo de «adicción oncogénica», en el cáncer de pulmón de células no pequeñas, la translocación del gen ALK con EML4 resulta en una proteína de fusión que activa vías de señalización, lo que permite la supervivencia y proliferación de las células cancerosas.

Alrededor de 5% de los cánceres de pulmón no microcíticos presentan reordenamiento en el genALK, este reordenamiento produce una proteína anormal ALK que causa que las células crezcan y se propaguen. Los medicamentos que atacan el gen ALK (Crizotinib (Xalkori®) y Ceritinib (Zykadia™) bloquean la proteína anormal ALK y pueden reducir el tamaño de los tumores en pacientes cuyos cánceres de pulmón tienen este cambio genético.

Las translocacionesALKaparecen comúnmente en un único subgrupo de pacientes con CPMN. Estos pacientes comparten muchos de los rasgos clínicos de pacientes con CPNM que tienen mutaciones deEGFR. Sin embargo, salvo muy raras excepciones, las translocacionesALKy las mutacionesEGFR son excluyentes, es por ello que sólo se estudiará el reordenamiento de ALK en aquellos pacientes que hayan dado ausencia de mutaciones en el gen EGFR (EGFR nativo o wild Type).

¿Con qué técnicas se debe determinar ALK?

En la actualidad existen fundamentalmente 3 técnicas que permiten detectar el reordenamiento del genALKen las muestras clínicas. Se trata de la inmunohistoquímica, de la hibridaciónin situ fluorescente (FISH) y la PCR con retro-transcripción (RT-PCR).

Los ensayos realizados mediante FISH (hibridación in situ fluorescente) para la determinación del reordenamiento deALKse consideran el método estándar por la FDA en la práctica clínica, considerándose el “gold estándar” para la evaluación del status ALK. Esta técnica permite la detección de diversas variables de reordenamientos de ese gen, pudiendo ser utilizada tanto en citología como en tejido fresco, congelados y parafinados, y es la única prueba que ha sido asociada con la respuesta a crizotinib (medicamento conocido como inhibidor de la tirosin-quinasa, que actúa bloqueando la acción de la misma evitando con ello la multiplicación de las células cancerosas).

K-RAS y N-RAS

Resumen y explicación de la prueba.

KRAS

Cetuximab y panitumumab son anticuerpos monoclonales cuya diana es el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y cuyo uso está aprobado en pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Si bien el EGFR se sobreexpresa en el 50%-80% de los tumores colorrectales, la expresión de la proteína EGFR y la amplificación génica sólo presentan un valor predictivo limitado a la hora de determinar la probabilidad de respuesta al cetuximab o al panitumumab. No obstante, actualmente existen pruebas sólidas que demuestran quela presencia de mutaciones KRAS se corresponde con la ausencia de respuesta al tratamiento mediante anticuerpos dirigidos contra el EGFR en pacientes con cáncer colorrectal metastásico y que, en algunos casos, el uso de dicho tratamientoen este subgrupo de pacientes puede resultar perjudicial.

La proteína KRAS es un miembro de la superfamilia de las proteínas G pequeñas que actúan como un interruptor que alterna GDP y GTP para transmitir señales extracelulares que influyen en la proliferación celular, la apoptosis y la remodelación del citoesqueleto de actina. Las mutaciones que afectan a los aminoácidos 12, 13 o 61, que se producen en diversos tumores malignos humanos, incluido el cáncer colorrectal (CRC) y el cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC), vinculan la enzima a la unión de GTP en su forma activada, lo que genera una señalización constitutiva que contribuye al proceso oncogénico.

Se observan mutaciones KRAS en el 24%-43% de los tumores colorrectales. Aunque se han identificado más de 3.000 mutaciones puntuales del gen KRAS, la mayoría se producen en los codones 12 o 13 (~82% en el codón 12 y ~17% en el codón 13).
Las mutaciones KRAS en otros codones (p. ej., el codón 61) son menos comunes (1%-4% de las mutaciones) pero,al igual que las mutaciones en los codones 12 y 13, generan una activación constitutiva de KRAS. Además, los datos publicados indican que las mutaciones en el codón 61 son predictivas de la ausencia de respuesta al tratamiento de anticuerpos monoclonales contra el EGFR.

La prueba de mutación cobas® KRAS es un ensayo basado en la PCR diseñado para identificar la presencia de mutaciones somáticas en los codones 12, 13 y 61 del protooncogén KRAS y, de este modo, identificar pacientes con CRC avanzado que presentan pocas posibilidades de beneficiarse del tratamiento con anticuerpos monoclonales contra el EGFR.

Para conocer el estado mutacional del gen, se realiza un test genético con una parte de la muestra tumoral que se le extrae al paciente para el diagnostico de la enfermedad, por lo que la determinación del estado mutacional del gen KRAS no supone una intervención adicional para el paciente.

Antes de que comience el proceso de determinación en sí, se lleva a cabo un control exhaustivo de calidad. Un patólogo se encarga de analizar la muestra de tejido canceroso extraída al paciente para confirmar si, tal como se sospecha, presenta células tumorales.A continuación, se purifica el ADN tumoral de la muestra para prepararlo para la realización del test. El siguiente paso consiste en la realización de un test de alta sensibilidad de KRAS, mediante la técnica conocida como PCR en tiempo real. De esta manera, se sabe si el tumor del paciente es KRAS nativo o KRAS mutado. Los resultados de dicha determinación permiten a los clínicos seleccionar el tratamiento dependiendo del estado del gen KRAS en cada tumor.

El resultado que se obtiene al realizar el estudio mutacional del gen KRAS puede ser tanto mutado (presencia de mutaciones en cualquiera de los codones anteriormente citados) como no mutado o nativo (wildType).

En aquellos cosos en los que se detecta ausencia de mutaciones, KRAS wild Type, está recomendado el estudio mutacional del gen NRAS.

NRAS se encuentra mutado en aproximadamente el 1-3% de los CCR, principalmente en el codón 61. Este fenómeno es mutuamente excluyente con las mutaciones de KRAS y es igualmente un factor predictivo negativo al tratamiento con anticuerpos antiEGFR.

B-RAF

Resumen y explicación de la prueba.

El gen BRAF forma parte de la familia de quinasas tipo serina-treonina que intervienen en la transducción de señales de la ruta MEK/ERK, una vía importante para la regulación celular, el crecimiento, la diferenciación y la promoción de la apoptosis.

La activación de las mutaciones en el protooncogén BRAF se produce en numerosos cánceres humanos, como el melanoma maligno, el cáncer colorrectal, el cáncer ovárico y el cáncer tiroideo. Se han identificado mutaciones de BRAF en el 40%-60% de los melanomas malignos. Las mutaciones de BRAF también son comunes en los nevi benignos, lo que sugiere que este tipo de mutaciones se producen de forma muy temprana. El descubrimiento de estas mutaciones somáticas en el gen BRAF en melanomas y otros tumores humanos ha ayudado a dilucidar la función esencial de la quinasa BRAF en la señalización de vías que controlan la proliferación y la diferenciación celular, así como la muerte celular. En las células normales, el gen BRAF forma parte de una vía de señalización muy regulada que interviene en los efectos de los receptores del factor de crecimiento (como el EGFR) a través de las vías RAS, RAF, MEK y ERK.

La mayoría de las mutaciones de BRAF en los melanomas y otros tumores humanos se producen en el codón 600. También se han observado, aunque de forma menos común, diversas mutaciones dinucleotídicas que afectan al codón 600 (V600K, V600R y V600D), principalmente en los melanomas y, con menor frecuencia, en otros tumores, como el cáncer colorrectal.

En la actualidad se están desarrollando inhibidores específicos que han demostrado su eficacia en melanomas portadores de esta mutación.

La prueba de mutación BRAF V600 para cobas® 4800 es un ensayo de PCR en tiempo real diseñado para detectar la presencia de la mutación V600E (T1799A).

Principios del procedimiento utilizado en nuestra unidad de anatomía patológica.

La prueba de mutación BRAF V600 para cobas® 4800 se basa en dos procesos básicos: (1) preparación manual de las muestras para obtener ADN genómico de un tejido impregnado en parafina y fijado en formalina (FFPET); (2) amplificación del ADN objetivo mediante PCR y un par de cebadores (primers) complementarios y dos sondas nucleótidas con marcadores fluorescentes distintos.

Una de las sondas se ha diseñado para detectar la secuencia BRAF V600 no mutada y la otra, para detectar la secuencia de la mutación V600E. También se incluyen dos controles de análisis externos y el alelo no mutado se utiliza como control interno para todo el proceso.

HOJA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA BIOLOGÍA MOLECULAR.

Hoja de Consentimiento Informado necesaria para cualquier prueba de Biología Molecular que se solicite en la UPIGAP

BIBLIOGRAFÍA.

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- Sistema cobas® 4800.Manual de usuario,Versión del programa 2.0 para la Prueba de mutación en EGFR de cobas® 4800. Roche.

- Sistema cobas® 4800.Manual de usuario,Versión del programa 2.0 para la Prueba de mutación en K-RAS de cobas® 4800. Roche.

-Sistema cobas® 4800.Manual de usuario,Versión del programa 2.0 para la Prueba de mutación en BRAFV600 para cobas® 4800. Roche.

- Sistema cobas® 4800.Manual de usuario,Versión del programa 2.0 para la Prueba de mutación en BRAFV600 para cobas® 4800. Roche.

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